Accessing natural diversity of rhamnolipids by metabolic engineering of Pseudomonas putida

  • Erschließung der natürlichen Diversität von Rhamnolipiden durch Metabolic Enginering von Pseudomonas putida

Tiso, Till; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor); Wichmann, Rolf (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2016)
Doktorarbeit

In: Applied microbiology 3
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (iii, 228 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Kurzfassung

Ein Großteil der Produkte, die wir jeden Tag benutzen basiert auf petrochemischen Prozessen. Ausgehend von innovativen biobasierten Prozessen und um die Schäden für die Umwelt zu verringern, wird Rohöl als Edukt mehr und mehr durch biologische Alternativen ersetzt. So werden auch in Haushaltsreinigungsmitteln biologisch hergestellte Tenside eingesetzt. Biotenside sind in der Herstellung jedoch immer noch deutlich teurer als ihre chemisch synthetisierten Kontrahenten. In dieser Arbeit wird ein rekombinanter Pseudomonas putida für die Synthese von Rhamnolipiden genutzt. Rhamnolipide sind Glykolipide und verfügen über Eigenschaften, wegen derer sie ein hohes Potential für industrielle Anwendungen aufweisen. Trotzdem wird die Herstellung von Rhamnolipiden mit dem Wildtyp Pseudomonas aeruginosa aufgrund einiger Schwierigkeiten nicht durchgeführt. Zunächst handelt es sich um ein (human-) Pathogen. Des Weiteren erfordert die Rhamnolipid Produktion mit P. aeruginosa den Einsatz von Pflanzenölen als Energie- und Kohlenstoffquelle, was die Aufreinigung sehr erschwert. Werden die entsprechenden Gene heterolog in P. putida exprimiert, ist diese mikrobielle Zell-fabrik dazu in der Lage, Rhamnolipide ausgehend von Glukose zu produzieren. Interessanter-weise ist die Synthese dieser Sekundärmetabolite entkoppelt vom Wachstum des Bakteriums, was komplexe Fermentationsverfahren vermeidet. Bei der detaillierten Betrachtung des zugrundeliegenden metabolischen Netzwerks fällt auf, dass P. putida seinen zentralen Kohlenstoffmetabolismus hochreguliert, um den zusätzlichen Bedarf zu decken. Diese Erkenntnis konnte in einer „metabolic engineering” Strategie genutzt werden, um eine effiziente Zelle zu konstruieren, die Titer von 3 g/L und Kohlenstoff Ausbeuten von 40% erreicht. Daraufhin konzentrierten wir uns darauf, die trankriptionelle Aktivität zu steigern, indem wir synthetische Promoterbanken einsetzten. Dieser Ansatz war auch tatsächlich sehr erfolgreich und lieferte eine große Bandbreite an Rhamnolipid-Produktivität. Jedoch war der hohe Fluss in Richtung Produkt nicht langfristig stabil. Nachdem wir die rekombinante Rhamnolipid-Produktion etabliert hatten, fokussierten wir uns darauf, das Produktspektrum aufzufächern. Anfangs synthetisierten wir lediglich mono-Rhamnolipide. Durch das gezielte Einbringen und Ausschalten von spezifischen Genen des Rhamnolipid Pfades, konnten wir außerdem di-Rhamnolipide und die Rhamnolipid-Vorstufe Hydroxyalkanoyloxy Alkansäure produzieren. Nachfolgend optimierten wir den Metabolismus des Wirtsorganismus und verbesserten die Fermentations-Strategie und Medien Zusammensetzungen. Mit diesen Maßnahmen waren wir in der Lage in einem Fed-Batch Kolbenexperiment Titer von bis zu 7 g/L an Tensiden zu erreichen. Die Ergebnisse werden im Kontext der rationalen Stammentwicklung für die Produktion von Designer-Tensiden diskutiert.

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