Bildung, Isolierung und Nachweis der mikrobiell gebildeten Speicherstoffe Polyphosphat und Polyhydroxybuttersäure bei ausgewählten Mikroorganismen

  • Formation, isolation and proof of the microbes produced storage substances polyphosphate and polyhydroxybutyric with selected microorganisms

Schacht, Petra Yvonne; Dott, Wolfgang (Thesis advisor); Blank, Lars Mathias (Thesis advisor)

Aachen (2016)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Kurzfassung

In der vorliegenden Arbeit wird ermittelt, inwieweit die Bildung der mikrobiellen Speicher-stoffe Polyphosphat und Polyhydroxybuttersäure gefördert werden kann und diese isoliert werden können. Zudem wird ihre Einsatzmöglichkeit, über die biologische Funktion hinaus, im Bereich umweltschonender Produkte und Technologien angesprochen. Bedingt durch die umfassende Methodenentwicklung und die Untersuchung beider Speicher-stoffe setzt sich die vorliegende Arbeit aus den drei Bereichen Nachweismethoden für die polymeren Verbindungen Polyphosphat und Polyhydroxybuttersäure, die mikrobielle Bildung von Polyphosphaten sowie die mikrobielle Bildung von Polyhydroxybuttersäure zusammen. Es wurden Versuchsreihen im Labormaßstab durchgeführt, in denen unter selektiver Anreicherung von Mikroorganismen die Speicherstoffe Polyphosphat und Polyhydroxy-buttersäure gebildet werden. Die Verfahren für die Isolierung und den qualitativen und quantitativen Nachweis der Speicherstoffe wurden entwickelt beziehungsweise etabliert. Die gebildeten Polyphosphate konnten qualitativ und quantitativ mittels Mikroskopie, Fluoreszenzphotometrie und Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Die Quantifizierung der Polyphosphate erfolgte nach Extraktion und durch Messung als Ortho-Phosphat. Allerdings bestehen bei den Nachweisverfahren methodische Schwierigkeiten hinsichtlich der Bestimmung der einzelnen Kettenlängen der Polyphosphate und deren Quantifizierung bedingt durch das Fehlen einheitlicher Standards. Die Ergebnisse sind deshalb kritisch zu betrachten und eine Optimierung der Nachweisverfahren ist anzustreben. Dennoch ist bei simultaner Betrachtung der Ergebnisse des Prozessablaufs aller angewendeten Nachweis-verfahren eine Übereinstimmung festzustellen, so dass die verschiedenen Methoden in der Kombination als zielführend angesehen werden können.Die gebildete Polyhydroxybuttersäure konnte aus der Zelle isoliert und qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden. Der Nachweis erfolgte mikroskopisch, enzymatisch und mittels Gaschromatographie. Die Nachweisverfahren für Polyhydroxybuttersäure brachten zufriedenstellende Ergebnisse, da geeignete Standardsubstanzen vorlagen. Die Phosphataufnahme und Polyphosphatspeicherung wurde anhand der Mikroorganismen im Klärschlamm und unter besonderer Berücksichtigung des Pilzes Cunninghamella elegans untersucht. Es wurde festgestellt, dass Phosphat vorwiegend als Polyphosphat in der Zelle durch die Aktivität von Mikroorganismen gespeichert wird. Bei ungünstigen Kultivierungs-bedingungen, wie der Änderung des pH-Wertes, kam es zusätzlich zu direkt oder indirekt induzierten Fällungsreaktionen, wie der chemischen Ausfällung von Struvit (Magnesium-Ammonium-Phosphat). Zur Beurteilung der Untersuchungsergebnisse wurde die Kohlenstoff/ Stickstoff/Phosphor-Bilanz im Medium herangezogen. Im Vergleich zu den Mikroorganismen im Klärschlamm war der Pilz Cunninghamella elegans in der Lage ein Zehnfaches an Phosphat aus dem Medium zu eliminieren und intrazellulär als Polyphosphat zu speichern. Cunninghamella elegans konnte maximal 10 % Phosphat in der Biomasse festlegen, während die Klärschlammbiozönose höchstens 3 % Phosphat fixierte. Bei Cunninghamella elegans ergaben sich ein vielversprechender Ertrag an Biomasse und eine Polyphosphatspeicherung in kurzer Zeit. Allerdings scheitert die technische Nutzung der Polyphosphatproduktion an der Abtrennung der Polyphosphate von der Biomasse, die ohne Hydrolyse nicht möglich ist. Die mikrobielle Bildung und Speicherung von Polyhydroxybuttersäure wurde anhand der Bakterien Paracoccus denitrificans und Cupriavidus necator untersucht. Trotz unter-schiedlicher Kultivierungsbedingungen und eines sehr hohen Kohlenstoffverbrauchs, ist es nicht gelungen einen hohen Ertrag an Biomasse und Polyhydroxybuttersäure zu erreichen. Eine Optimierung der Verfahren ist deshalb notwendig. Die höchste Ausbeute an 3-Hydroxy-buttersäure betrug bei Paracoccus denitrificans und Cupriavidus necator maximal 50 % des Trockengewichts. Angesichts der im Labormaßstab erzielten Untersuchungsergebnisse sollte eine Über-tragung auf großtechnische Maßstäbe angedacht und untersucht werden. Um eine wirtschaftliche Einsatzmöglichkeit der Speicherstoffe zu erreichen, sind eine hohe Zelldichte an Mikroorganismen und damit eine hohe Ausbeute unumgänglich. Deshalb wurden für jeden Speicherstoff die untersuchten Mikroorganismen individuell ausgewählt. Zur Senkung der Produktionskosten bei der Polymerherstellung erscheint die Weiter-verarbeitung industrieller Abwässer ein Ansatzpunkt zu sein. Im Rahmen der Arbeit wurde anfallendes Prozesswasser aus der Industrie als Phosphatquelle den verwendeten Medien zugeführt und getestet. Die Isolierung und Quantifizierung der gebildeten Speicherstoffe aus Mikroorganismen ist, trotz Fortschritten in der Speicherstoffforschung, noch schwierig, da sich durch Hydrolyse Verluste ergeben können.Die Bildung und Gewinnung der mikrobiellen Speicherstoffe Polyphosphat und Poly-hydroxybuttersäure ist zurzeit noch nicht wirtschaftlich und nur bedingt technisch realisierbar.

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