Engineering redox metabolism of Pseudomonas putida KT2440

  • Engineering des Redox Metabolismus von Pseudomonas putida KT2440

Zobel, Sebastian; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor); Büchs, Jochen (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2016, 2017)
Doktorarbeit

In: Applied microbiology 4
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XII, 99 Seiten) : Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Kurzfassung

Das bekannte Bodenbakterium Pseudomonas putida gewinnt größer werdendes Interesse für eine Anwendung in der industriellen Biotechnologie. Trotz seiner bemerkenswerten natürlichen Fähigkeiten muss dieser Organismus für eine industrielle Anwendung optimiert werden, um Anforderungen industrieller Prozesse, wie bspw. das Aufrechterhalten einer homogenen katalytischen Aktivität und einer effizienten Versorgung mit Reduktionsäquivalenten, zu genügen. Aufgrund dieser Hürden bestand das Ziel dieser Arbeit i) sowohl in der Entwicklung eines genetischen Werkzeugs, das die Expressionsvariabilität minimiert als auch ii) in der Steigerung der NADH Regenrationsrate mit dem Ziel eines überproduzierenden Stammes, der für den Einsatz in der Redox Biokatalyse geeignet ist.Um das erste Ziel zu erreichen, wurde ein genetisches Element entwickelt, das in eine definierte und nur einmal existierende Stelle im Genom integriert und so Schwankungen der Kopieanzahl klassischer Vektorsysteme umgeht. Das Hauptelement dieses Werkzeugs besteht aus einem synthetischen Promoter, der über ein Verbindungsstück an das zu exprimierende Gen gekoppelt ist. Hierbei bestimmt nur der synthetische Promoter die Expressionsstärke. Die Zuverlässigkeit dieses Werkzeuges wurde anhand von Fluoreszenzmessungen mit genomisch integrierten Konstrukten mit sich im Wachstum befindenden P. putida KT2440 Kulturen nachgewiesen. So konnte eine kalibrierte Bibliothek synthetischer Promotoren entwickelt werden, deren Aktivitäten sich um das bis zu 30-fache unterscheiden. Das modulare Baukastensystem ermöglicht einfaches Austauschen des zu exprimierenden Gens. Das Werkzeug ist für einen breiten mikrobiologischen Einsatz konzipiert. Das zweite Ziel wurde auf unterschiedliche Weise verfolgt. Da im zentralen Kohlenstoffwechselweg das meiste NADH regeneriert wird, wurde versucht, über eine erhöhte Glukoseaufnahmerate eine erhöhte NADH Regenerationsrate zu erzielen. In E. coli wurde gezeigt, dass der Bedarf an ATP die Glukoseaufnahmerate kontrolliert. Daher wurde eine ATP verschwendende Reaktion in P. putida integriert, die, wahrscheinlich aufgrund von Regulationsmechanismen, nicht zu einer erhöhten Glukoseaufnahmerate führte. Das Ziel einer erhöhten NADH Regenerationsrate wurde dennoch über einen zweiten Ansatz erreicht. Hierbei wurde gezeigt, dass Formiat von P. putida KT2440 über eine NAD+-abhängige Formiatdehydrogenase zu CO2 und NADH oxidiert wird. In einer Co-Verstoffwechslung mit Glukose konnte so zusätzliches NADH bereitgestellt werden, das zu einer erhöhten Biomasseausbeute auf Glukose führte. Dieser vielversprechende Ansatz könnte die Redox Biokatalyse mit P. putida unter prozessrelevanten Bedingungen unterstützen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein einfach durchzuführender Ganzzell-Assay entwickelt, der das Screening von Cosubstraten ermöglicht, die eine erhöhte NADH Regenerationsrate verursachen.Durch die Entwicklung eines zuverlässigen Expressionswerkzeugs und die gut beschriebene Nutzung von Formiat als Donor von Elektronen zur Erhöhung der NADH Regenerationsrate tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zur Entwicklung von P. putida KT2440 als Platformwirt der industriellen Biotechnologie bei.

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