Metabolic engineering of microbial hosts for the biosynthesis of high molecular weight hyaluronan

Aachen / Apprimus (2018) [Buch, Doktorarbeit]

Seite(n): 1 Online-Ressource (IX, 124 Seiten) : Illustrationen

Kurzfassung

Hyaluronsäure (HA) ist ein lineares Polysaccharid bestehend aus Glucuronsäure und NAcetylglucosamin. Da HA ein beliebter Inhaltsstoff in medizinischen und kosmetischen Produkten ist, steigt die Nachfrage nach dieser Substanz stetig. Vor allem hochmolekulare HA ist von Bedeutung, deren Gewinnung zurzeit vorwiegend aus Tierprodukten erfolgt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, einen mikrobiellen Wirt für die Produktion hochmolekularer HA zu etablieren. Mithilfe synthetischer Biologie sollte auch die Verwendung alternativer Kohlenstoffquellen, genauer Sucrose und N-Acetylglucosamin, sowie deren direkte Einbringung in die HA-Vorläufer-Synthese ermöglicht werden. Zwei Strategien zur Produktion von HA mit hohem Molekulargewicht (MW) wurden untersucht. Die Eignung der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Expressionswirt für eukaryotische HASynthasen wurde evaluiert, da eukaryotische Synthasen laut Literatur ein hohes MW produzieren. Außerdem wurde das MW verschiedener Streptokokken-Synthasen bei Expression inrekombinanten Lactococcus lactis untersucht. Die Produktion hochmolekularer HA in S. cerevisiae benötigt nicht nur eine funktionale Synthase, sondern auch einen Syntheseweg für den Vorläufer UDP-Glucuronsäure. Hierfür wurde der in Streptokokken vorhandene Weg untersucht. Außerdem wurden synthetische Stoffwechselwegedesignt, die die Verwendung der alternativen Kohlenstoffquellen Sucrose und NAcetylglucosamin ermöglichen sollten. Das finale Hefe-Chassis sollte zwei Module für die Herstellung der HA-Vorläufer sowie die HA-Synthase enthalten. Es stellte sich heraus, dass S. cerevisiae kein geeigneter Wirt für rekombinante HA Produktion ist. Obwohl eine HA Synthase in vitro Aktivität zeigte, erfolgte keine HA Synthese in vivo. Mithilfe von yeGFP-Fusionskonstrukten wurde gezeigt, dass die Synthasen nicht korrekt lokalisieren. Fluoreszenzwurde in intrazellulären Kompartimenten, aber nicht an der Plasmamembran beobachtet. Demnach wurde der synthetische Biosyntheseweg für UDP-N-Acetylglucosamin nicht detailliert untersucht, da S. cerevisiae einen nativen Weg besitzt. In Bezug auf die UDP-Glucuronsäure-Biosynthese wurde ein Sucrose-negatives Chassis erfolgreich konstruiert. Funktionalität derSucrose Synthase und Biosynthese von UDP-Glucuronsäure konnten im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht gezeigt werden. Die von Streptococcus zooepidemicus produzierte HA ist gut charakterisiert und kommerziell erhältlich. Das Potenzial anderer Streptokokken-Synthasen ist jedoch noch nicht untersucht, daher wurde in dieser Arbeit nach weiteren mikrobiellen HA-Synthasen gesucht und zwei neue Kandidaten gefunden: Streptococcus iniae und Streptococcus parauberis. Die sechs getesteten HASynthasen produzierten in der Tat unterschiedliche MWs: Streptococcus pyogenes produzierte ein weitgeringeres MW als Streptococcus uberis und Streptococcus parauberis, sowohl in vitro als auch in vivo. Die gezielte Produktion von hochmolekularer HA bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen nicht nur zur aktuellen Forschung bezüglich der Produktion langkettiger HA bei, sondern auch zum Konzept der Chassis-Konstruktion inklusive der Nutzung alternativer Kohlenstoffquellen.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Schulte, Sandra

Gutachterinnen und Gutachter

Blank, Lars Mathias
Elling, Lothar

Identifikationsnummern

  • ISBN: 978-3-86359-629-3
  • REPORT NUMBER: RWTH-2018-224575