What happens in yeast during the Crabtree effect? : an investigation of S. cerevisiae’s volatile space

Halbfeld, Christoph; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor); Baumbach, Jörg Ingo (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2018)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology ; Volume 8 8
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XV, 148 Seiten) : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist einer der am besten untersuchten Organismen und wird häufig in der Wissenschaft genutzt. Dieses wissenschaftliche Interesse beruht teilweise auf der industriellen Nutzung von Hefe bei der Produktion von Medikamenten, Getränken und Nahrungsmitteln. Obwohl der Geschmack von Nahrungsmitteln und Getränken deutlich von flüchtigen Metaboliten beeinflusst wird, ist das Volatilom, also die Gesamtheit der produzierten flüchtigen Metabolite, bei Hefen bisher noch weitgehend unerforscht, mit Ausnahme der prominenten Ausnahmen Ethanol und Acetaldehyd. In dieser Arbeit wurde in Kapitel 2.1 die Literatur nach flüchtigen Metaboliten durchsucht und ein metabolisches Modell von S. cerevisiae durch deren Integration verbessert. Zusätzlich zu den gefundenen Metaboliten wurden Substanzen und Reaktionen in das Modell eingepflegt, um die hinzugefügten volatilen Metaboliten mit dem bereits vorhandenen Netzwerk zu verbinden. Insgesamt wurden 225 Metaboliten und 219 Reaktionen zu dem Modell hinzugefügt. Zudem konnten 12 metabolische Reaktionen durch physiologische und enzymatische Versuche mit knockout-Mutanten verifiziert werden. Die Mutanten wurden durch Anwendung des CRISPR-Cas9-Systems erzeugt und enthalten jeweils nur ein Gen, welches für ein Protein mit Alkoholdehydrogenaseaktivität kodiert. In Kapitel 2.2 wurden die flüchtigen Metabolite einer kontinuierlichen, respiratorischen Saccharomyces cerevisiae-Kultur während der Induktion des Crabtree-Effekts untersucht. Dafür wurden die Abluft der Fermentation direkt in ein SESI (Sekundäre Elektrospray-Ionisation)-Orbitrap Massenspektrometer (MS) geleitet, wo sie in Echtzeit analysiert wurde. Pro Experiment wurden ca. 2.500 Signale aufgenommen, 16 von diesen zeigten nach der Perturbation des metabolischen Zustandes, noch bevor Ethanol detektiert wurde, eine Änderung in der Signalintensität. Diese Ergebnisse verdeutlichen nicht nur die Größe des Hefe-Volatiloms, sondern zeigen ebenfalls, dass die Dynamiken der volatilen Metabolite im Gasraum über Hefefermentationen mit dem metabolischen Zustand der Zellen korrelieren. Daher könnte eine nicht-invasive und schnelle online-Analysemethode für das Überwachen von Hefekulturen dazu geeignet sein, Fermentationsprozesse zu kontrollieren. Genau dies wurde in Kapitel 2.3 untersucht, dazu wurde die Analyse des Gasraums über einer Hefefermentation mit einem Multikapillarsäulen-Ionen-Mobilitäts-Spektrometer (MCC-IMS) etabliert. Dieses analytische Gerät wurde ausgewählt, da es bei Normaldruck und Raumtemperatur betrieben werden kann. Im Vergleich zur SESI-Orbitrap-MS sind für das MCC-IMS geringere Wartungskosten aufzubringen und auch die Anschaffungskosten des MCC-IMS liegen deutlich unter denen der SESI-Orbitrap-MS. Das hier verwendete MCC-IMS wurde für die Detektion von Metaboliten in menschlicher Ausatemluft konzipiert, so dass einige technische Anpassungen vorgenommen werden mussten, um eine robuste Detektion der volatilen Metaboliten von Hefefermentationen zu ermöglichen. In Kapitel 2.4 wurde das optimierte MCC-IMS verwendet, um Metabolitkonzentrations-Veränderungen im Gasraum über Hefefermentationen während dem Übergang von ausschließlich respirativem hin zu respirofermentativem Wachstum (Crabtree-Effekt) zu untersuchen. Unter diesen Bedingungen wurde auch mithilfe eines cDNA-Microarrays die Änderungen auf transkriptioneller Ebene untersucht. Für diese Versuche wurde ein Laborstamm und ein industriell genutzter Stamm verwendet. Die metabolischen Veränderungen spiegelten sich im Gasraum der beiden unterschiedlichen Hefestämme deutlich wieder. Im Transkriptom konnten Unterscheide in der Regulation der Gene, die mit dem Leucin- und Isoleucin-Metabolismus zusammenhängen, sowie bei den für die Atmung und den Citratzyklus zuständigen Genen festgestellt werden. Überraschend war, dass die mit der Atmung assoziierten Gene im Industriestamm mit Änderung des metabolischen Zustandes hochreguliert wurden, während die gleichen Gene im Laborstamm herunterreguliert wurden. Im letzten Teil der Arbeit werden mögliche Anwendungen für das in dieser Arbeit generierte Wissen diskutiert. So könnte diese Dissertation als Vorlage für die Untersuchung von Volatilen anderer Organismen genutzt werden. Das erweiterte metabolische Modell könnte dazu verwendet werden, Hefestämme mit besonderen Aromen für die Produktion von Duftstoffen, Parfums oder als Vorläufer für Medikamente, zu entwerfen. Darüber hinaus könnte das hier generierte Wissen über die Veränderung flüchtiger Metabolite während einer metabolischen Zustandsänderung ebenfalls dazu verwendet werden, um eine Fermentation mittels online-Analytik zu kontrollieren. Letztlich könnten die hier entwickelten analytischen Methoden zur online-Flussanalyse genutzt werden, falls noch weitere der hier detektierten flüchtigen Metabolite identifiziert werden.

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