High quality $^{13}$C metabolic flux analysis using GC-MS

  • Hochqualitative $^{13}$C Stoffflussanalyse mittels GC-MS

Schmitz, Andreas; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor); Oldiges, Marco (Thesis advisor)

1st ed.. - Aachen : Apprimus-Verlag (2018)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology 10
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XVII, 140 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Zur Reduzierung des Bedarfs fossiler Rohstoffe wie Erdöl oder Erdgas werden immer häufiger biotechnologische Prozesse angewandt, um Produkte unter Verwendung biologischer Wirtsorganismen herzustellen. Zur Steigerung der Produktionseffizienz werden diese Organismen meist mittels Metabolic Engineering optimiert. Bevor die Organismen mittels Metabolic Engineering verändert werden ist es notwendig, die intrazellulären Vorgänge zu kennen. Diese Vorgänge müssen im Vorfeld mit Methoden wie der $^{13}$C-Stoffflussanalyse(MFA) untersucht werden. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Optimierung der Analytik zur Messung der $^{13}$C-Markierung von Metaboliten. Zunächst wurde der Einfluss, der für die $^{13}$C-MFA gängigen Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Methoden auf die Datenqualität von proteinogenen Aminosäuren untersucht. Der Scanmodus, die Integrationsmethode sowie die Menge der analysierten Biomasse stellten sich als Haupteinflussfaktoren auf die Qualität der Markierungsdaten dar. Im Durchschnitt konnte die Datenqualität durch die Messung mittels Selected-Ion-Monitoring (SIM) um den Faktor 3.5 verbessert werden. Hierfür erstellten wir ein detailliertes Protokoll, das Wissenschaftlern ohne Erfahrungen auf diesem Fachgebiet die Probenvorbereitung sowie GC-MS Analyse beschreibt und somit eine einfache Messung der Markierungsdaten zur $^{13}$C-MFA ermöglicht. In der biotechnologischen Forschung wird es immer relevanter auch Markierungsdaten von intrazellulären Metaboliten für die $^{13}$C-MFA zu verwenden. Hierdurch benötigen die Experimente weniger Zeit, wodurch die Kosten für $^{13}$C-Substrate gesenkt werden können. Als weitaus wichtiger kann jedoch die Anwendung der Analyse für Experimente betrachtet werden, bei denen das Einstellen des metabolisch stationären Zustandes nicht möglich ist. Dazu wurden Probenvorbereitungs- und Messmethoden zur Markierungsbestimmung von intrazellulären Metaboliten implementiert und weiterentwickelt. Aufgrund der hohen Umsatzraten von intrazellulären Metaboliten während des Wachstums wurde besonderes Augenmerk auf die unverzügliche Unterbrechung der intrazellulären Prozesse gelegt. Metabolit-Quenching wurde mit kalter Ethanol-Kochsalz-Lösung durchgeführt und die intrazellulären Metabolite anschließend mittels kalter Methanol-Chloroform-Wasser-Lösung extrahiert. Die entwickelten Methoden wurden für eine eingehende Untersuchung der Glukoseaufnahme sowie zur Untersuchung von zyklischen Flüssen durch den Entner-Doudoroff Stoffwechselweg in Pseudomonaden verwendet. Im Vergleich zu $^{13}$C-MFA mit proteinogenen Aminosäuren konnte der Informationsgehalt durch die Verwendung intrazellulärer Metabolite erhöht und somit zusätzliche Stoffflüsse aufgelöst werden. Neben klassischen GC-MS-Ansätzen wurden GC-Tandem MS (MS/MS) Analysendurchgeführt. Hierdurch sollten Informationen über die Position von $^{13}$C-Isotopen in der Aminosäuren durch einen zweiten Fragmentierungsschritt gewonnen werden, um zusätzliche Stoffflüsse aufzulösen zu können. Für diese GC-MS/MS Messungen wurden die Zellen wie bei der klassischen Analyse von Aminosäuren mit GC-MS vorbereitet. Leucin und Lysin erwiesen sich als vielversprechende Aminosäuren im Hinblick auf die Acetyl-CoA Markierung von S. cerevisiae. Experimente mit 1-$^{13}$C-Glucose und U-$^{13}$C-Glucose ergaben Unterschiede in der cytosolischen und mitochondrialen Acetyl-CoA Markierung, was auf einen geringen Austausch zwischen diesen beiden Kompartimenten hindeutet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Techniken sind hochentwickelte Methoden zur Bestimmung der Metabolitenmarkierung. Die durch die Anwendung dieser Methoden gewonnenen Informationen, sind für die Verwendung in $^{13}$C-MFA geeignet und ermöglichen somit einen tieferen Einblick in die Stoffwechselaktivität in der Zelle.

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