Adaption to hypoxia and nutrient depletion determines therapy sensitivity of cholangiocarcinoma

Wappler, Jessica; Cramer, Thorsten (Thesis advisor); Blank, Lars Mathias (Thesis advisor); van Dongen, Joost Thomas (Thesis advisor)

Aachen (2018)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Ein zentrales Problem bei der Entwicklung effektiver Therapien gegen das Cholangiozelluläre Karzinom (CCC) stellt dessen natürliche anatomische Diversität und molekularbiologische Heterogenität dar. Der Großteil der CCC Patienten wird mit nicht resezierbaren Tumoren vorstellig, deren ‚Gold Standard‘ Therapie aus palliativer Chemotherapie mit Gemcitabine und/oder Cisplatin besteht. Die Ansprechraten sind gering, sodass ein besseres Verständnis zugrundeliegender Resistenz-mechanismen die Entwicklung neuer Therapien erleichtern könnte. Ein Faktor, der die zelluläre Sensitivität für Zytostatika maßgeblich beeinflussen kann ist das Mikromilieu des Tumors. Insbesondere Sauerstoff- und Nährstoffmangel sind ein häufig auftretendes Phänomen in soliden Tumoren und für beide Faktoren wurde ein Aggressivitäts- und Resistenzvermittelnder Effekt auf Tumorzellen nachgewiesen. Da die nicht-essentielle Aminosäure Glutamin eine wesentliche Rolle für den Metabolismus zahlreicher Tumorarten einnimmt, war das Ziel dieser Arbeit, die allgemeine Bedeutung von Glutamin für das CCC zu definieren und deren Effekt auf Chemotherapie im Rahmen zusammentreffender Hypoxie zu analysieren. Eine Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI MSI) Analyse zeigte, dass CCC-Patienten häufig Glutaminarme Areale in der Tumorkernregion aufweisen. In-vitro Experimente zeigten zudem, dass die Proliferation von CCC-Ziellinien stark abhängig von der verfügbaren Glutamin-konzentration ist. Durch graduelle Reduktion konnten zwei extrahepatische CCC (eCCC)-Zelllinien (EGI-1 und TFK-1) ihre Glutamin-abhängigkeit überwinden. Die durch den Selektionsprozess etablierten Zelllinien (EGI-1 GD und TFK-1 GD) proliferierten unabhängig von Glutamin. Mithilfe eines extrazellulären Flux Analysers konnte gezeigt werden, dass die mitochondriale Respiration in TFK-1-Zellen stark durch Glutamindepletion beeinflusst wird und möglicherweise eine Verlagerung auf glykolytische Energiegewinnung während des Adaptationsprozesses zur Folge hat. Da der Effekt von Hypoxie und langfristiger Glutamindepletion weitgehend unbekannt ist, wurden eCCA GD-Ziellinien mit Cisplatin oder Gemcitabine in Anhängigkeit von der Sauerstoffverfügbarkeit behandelt. Unter normoxischen Bedingungen führte Glutamindepletion zu einer verringerten Sensitivität gegenüber beiden Chemotherapeutika. Unter Hypoxie (1% O2) zeigten beide parentalen Zelllinien eine induzierte Chemoresistenz, während diese bei den eCCA GD-Zelllinien nach Cisplatinbehandlung nicht auftrat. Untersuchungen der molekularen Antwort der Zelllinien auf Hypoxie ergaben, dass diese durch den Adaptationsprozess nicht verändert wurde und vermutlich nicht für die fehlende Chemoresistenz in eCCA GD-Zelllinien verantwortlich ist. Das Onkoprotein c-Myc spielt eine wichtige Rolle im Glutaminmetabolismus von Tumorzellen und es konnte nachgewiesen werden, dass Glutamindepletion in eCCA-Zellen zu einer Reduktion von c-Myc führt. Interessanterweise zeigten eCCA GD-Zelllinien eine Normalisierung des c-Myc Proteinlevels auf das Level der Glutaminsupplementierten parentalen Zelllinien. Nach Cisplatinbehandlung zeigten beide eCCA-Zelllinien identische c-Myc Proteinlevel unabhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit, während Hypoxie eine c-Myc Reduktion in eCCA GD-Zelllinien vermittelte. Diese Ergebnisse zeigen, dass c-Myc Bedeutung für die fehlende Cisplatinresistenz in eCCA GD-Zelllinien haben könnte. Um die anatomische Diversität und damit Heterogenität des CCCs abzubilden, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Antwort auf Chemotherapie in Abhängigkeit von der Sauerstoffverfügbarkeit vergleichend in eCCA- und intrahepatischen (iCCA)-Zelllinien zu analysieren. Während beide eCCA-Zelllinien sehr empfindlich auf Hypoxie reagieren, waren bei den untersuchten iCCA-Zelllinien (CC-LP-1 und SNU-1079) abhängig vom Sauerstoffgehalt keine Unterschiede hinsichtlich ihrer Proliferation nachzuweisen. Die Experimente zeigten zudem, dass iCCA-Zelllinien zum Teil eine deutlich geringere Empfindlichkeit gegenüber den getesteten Zytostatika aufweisen und keine Hypoxie-induzierte Cisplatinresistenz zeigen. Interessanterweise demonstrierte eine Analyse der CCC-Patientenkohorte, dass eine signifikante Korrelation zwischen Zytostatikabehandlung und γH2AX-positiven Tumoren, sowie ein Trend zu einer erhöhten Überlebensrate in Klatskin-Tumorpatienten, nicht aber in iCCA-Patienten besteht. Zusammenfassend weisen die Daten darauf hin, dass eine Langzeit-Glutamindeprivation den Resistenz-vermittelnden Effekt von Hypoxie nicht verstärkt, sondern aufhebt. Dies spricht dafür, dass die zellulären Adaptationsmechanismen an ein verändertes Mikromilieu des Tumors möglicherweise komplexer sind, als bisher vermutet. Weiterhin scheint der anatomische Ursprung des Tumors die Abhängigkeit von Sauerstoff zu bedingen. Da beide Subklassen zudem eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika zeigen, könnte eine personalisierte Therapie sinnvoll sein.

Identifikationsnummern