Genome based investigations towards understanding carbon source dependent bioelectrochemical activity of Pseudomonas aeruginosa strains

Berger, Carola; Agler-Rosenbaum, Miriam (Thesis advisor); Blank, Lars Mathias (Thesis advisor)

Aachen (2019)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Das ubiquitär verbreitet Bakterium Pseudomonas aeruginosa ist in der Lage, elektrischen Strom in bioelektrochemischen Systemen (BES) zu erzeugen. Hierbei wird der Elektronentransport zur Anode durch zelleigene redoxaktive Mediatoren, die so genannten Phenazine, ermöglicht. Die Bildung dieser farbigen Moleküle gehört zu den charakteristischen Eigenschaften von P. aeruginosa. Bei ausreichender Konzentration können sie auch mit bloßem Auge auf Festmedien und in Submerskulturen wahrgenommen werden. Während der Stammhaltung von P. aeruginosa PA14 sekretierten einige Kolonien deutlich reduzierte Mengen an Phenazinen. In Abhängigkeit von der genutzten Kohlenstoffquelle zeigte jenes Isolat ein stark verändertes Zeitprofil oder eine signifikant reduzierte Phenazin-Biosynthese und damit einhergehende Veränderung der Stromgeneration. Sequenzierung beider Kolonieformen ergab eine Deletion von zwei Basenpaaren im LasR kodierenden Gen des Stammes, welcher die geringeren Mengen an Phenazinen produzierte. LasR dient im komplexen quorum sensing (QS) System von P. aeruginosa als übergeordneter Regulator, welcher die Expression einer Vielzahl von Genen direkt oder indirekt beeinflusst. Zu diesen Zielen gehören auch die Operons der Phenazin-Biosynthese. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die kohlenstoffquellenabhängige, veränderte Phenazin- und Stromproduktion der beiden Phänotypen mit der lasR Expression korreliert und erklärt werden kann. Zudem legen die vorgestellten Ergebnisse eine lasR abhängige Signalverknüpfung zwischen 2,3-Butandiol (2,3-BD) und dem QS Regulationssystem nahe. Neben der verwendeten Kohlenstoffquelle hat auch der eingesetzte P. aeruginosa Stamm einen großen Einfluss auf die Fähigkeit zur Stromerzeugung in einem BES. Um besser verstehen zu können, was das, aus einem BES stammende, Umweltisolat KRP1 zu einem herausragenden Kandidaten für weiterführende Forschung auf dem Gebiet der mikrobiellen Brennstoffzellen macht, wurde sein Gesamtgenom sequenziert und im Detail analysiert. Im Zuge dieser Analyse konnte die zuvor fragliche Zugehörigkeit des Stammes zu der Art P. aeruginosa eindeutig bestätigt werden. Zudem wurde die Organisation des KRP1 Genoms im Hinblick auf das Vorkommen genomischer Inseln untersucht. Diese sind Abschnitte der DNS, welche nicht allen Mitgliedern der Spezies P. aeruginosa gemein sind. Durch Nutzung verschiedener bioinformatischer Programme konnten 18 solcher Inseln identifiziert werden, deren addierte Länge ca. 10% des Gesamtgenoms ausmacht. Viele der Inseln wurden, zumindest in Teilen, bereits in anderen sequenzierten P. aeruginosa Stämmen gefunden. So enthält KRP1 unter anderem alle genomischen Inseln, die zuvor im hochvirulenten PSE9 Stamm nachgewiesen wurden. Des Weiteren wurden viele Inseln gefunden, die für die erhöhte Virulenz des Liverpool Epidemic Strain (LES) verantwortlich gemacht werden. Diese Funde legen die Schlussfolgerung nahe, dass es sich bei dem BES-Isolat KRP1 selbst um einen hochvirulenten P. aeruginosa Stamm handelt. Die in dieser Arbeit erzeugten Genomsequenzen der Stämme PA14 und KRP1 bildeten eine ideale Grundlage für die weiterführende Untersuchung des regulatorischen Netzwerks zur Erforschung der Ursachen der zuvor gezeigten Abhängigkeit der Stromerzeugung von Stamm und Kohlenstoffquelle. Um einen möglichst umfassenden Einblick in die zusammenhängenden Stoffwechselwege zu gewinnen, wurde eine Untersuchung des Gesamt-Transkriptoms gewählt. Für beide Stämme wurden jeweils individuelle RNA Sequenzierungen für planktonische und aus Biofilm entnommene BES Zellen, die unter Nutzung von jeweils 2,3-BD oder Glukose als Kohlenstoffquelle gewachsen sind, vorgenommen. Durch die Erstellung eigener Bibliotheken für jeden Stamm, jede Subpopulation und jede Kohlenstoffquelle, konnten verschiedene Sätze differentieller Genexpressionsvergleichsanalysen durchgeführt werden. Damit war es möglich, durch Nutzung unterschiedlicher Kohlenstoffquellen ausgelöste Effekte von jenen zu unterscheiden, welche durch die unterschiedlichen Wachstumsstile verursacht werden. Die Transkriptionsdaten dieser Arbeit zeigen unter anderem, dass der im oberen Bereich des Bioreaktors, an der Grenzfläche von Luft und Medium, gebildete Biofilm aktiver Phenazine produziert als die planktonischen Zellen. Auf Grundlage der Daten ist anzunehmen, dass nur ein geringer Anteil dieser Phenazinmoleküle in das darunterliegende Medium diffundiert, wo sie aktiv zur Stromproduktion beitragen. Der indirekte Elektronentransfer mittels redoxaktiver Phenazine in einem BES setzt mehrere Reduktions- und Oxidationszyklen der individuellen Mediatormoleküle voraus. Über die Reduktion von Phenazinen durch P. aeruginosa in vivo ist bislang jedoch nur wenig bekannt. In dieser Arbeit konnten potentielle Enzyme identifiziert werden, die eine unspezifische in vivo Reduktion der Phenazine gegebenenfalls katalysieren. Zudem wird eine Begründung für die schnellere Umsetzung der Kohlenstoffquelle 2,3-BD, bei gleichzeitiger erhöhter Katabolitenrepression, im Vergleich zu Glucose aufgezeigt.

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