Engineering the morphology and metabolism of Ustilago to expand the process window for itaconic acid production

Hosseinpour Tehrani, Hamed; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor); Wierckx, Nick (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2019)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology 13
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XIII, 159 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Itaconsäure ist aufgrund seiner beiden funktionellen Gruppen ein vielseitiger Baustein in der Polymerindustrie. Durch radikale Polymerisation der Methylengruppe und/oder durch Veresterung der Carboxylgruppen mit einer großen Anzahl an möglichen Co-Monomeren wird ein breites Anwendungsspektrum ermöglicht. Seit 1950 wird Aspergillus terreus zur Herstellung von Itaconsäure eingesetzt. Trotz der langen Historie und Erfahrung ist die Itaconsäure-Produktion in A. terreus eine anspruchsvolle Aufgabe und die Kontrolle der Morphologie führt zu hohen Kosten, die zu einem kleinen Marktanteil trotz seiner guten chemischen Eigenschaften führt. Aufgrund guter wissenschaftlicher Grundlagen und ihrer Robustheit sind Ustilaginaceae vielversprechende alternative Biokatalysatoren, die neue Möglichkeiten bieten um eine effizientere Itaconsäure-Produktion zu erreichen. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war eine effiziente Itaconsäure-Produktion aus Glukose mit Ustilaginaceae. In einem Screening mehrerer Ustilaginaceae konnten für alle getesteten Stämme genetische Grundlagen für die Itaconsäure-Produktion bestimmt werden. Neben Ustilago maydis, der ein gut untersuchter Wirt für die Itaconsäure-Produktion ist, wurde Ustilago cynodontis wegen seiner Toleranz gegenüber niedrigem pH-Werten gewählt. Die Untersuchung von an der Itaconat- und (S)-2-hydroxyparaconatbiosynthese beteiligten mitochondrialen und extrazellulären Transportern von U. maydis und A. terreus ergaben, dass der mitochondriale Transporter von A. terreus eine effizientere Itaconsäure-Produktion in U. maydis und in U. cynodontis ermöglicht. Die Itaconsäure-Produktion konnte in beiden Stämmen durch Deletion der Itaconat-Oxidase, tausch des nativen Promoter Pria1 durch Petef in U. maydis oder durch eine Überexpression vom Regulator ria1 in U. cynodontis weiter verbessert werden. So konnte die Produktion in U. maydis um das 4,2-fache und in U. cynodontis um das 6,5-fache gesteigert werden. Um diese genetischen Veränderungen umzusetzen, wurde CRISPR/Cas9 Technologie oder FLP/FRT-Systeme angewandt. Um ein robustes Zellwachstum unter prozessrelevanten Bedingungen zu gewährleisten, wurden beide Stämme in einem morphologischen Ansatz modifiziert. Dazu wurde das Gen fuz7, welches Teil der Ras/mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Kaskade ist und eine wichtige Rolle beim filamentösen Wachstum einnimmt, deletiert. Die dadurch entstandenen hefeähnlichen Zellen eröffnen somit neue Möglichkeiten im Bereich der Prozessentwicklung.Somit konnte erstmals die Itaconsäure-Produktion in einem Bioreaktor mit dem sonst stark filamentös wachsendem U. cynodontis realisiert werden. Durch Optimierung des pH-Wertes, der Fütterungsstrategien und durch Zellrückgewinnungssysteme konnten Titer bis zu 83 g L-1 mit einer Ausbeute von 0,45 gITA gGLC-1 und einer maximalen Produktivität von 1,4 g L-1 h-1 erreicht werden. Für U. maydis wurden durch Fermentationen in Kombination mit der in situ Produktentfernung mittels Calciumcarbonatfällung Titer von 220 g L-1 Itaconsäure erreicht. Dieser Wert ist der bisher höchste erreichte Itaconsäure-Titer der Mikrobiell hergestellt wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch einen integrierten Ansatz durch Metabolic- und Morphological Engineering gekoppelt mit der Prozessentwicklung die Effizienz der Itaconsäure-Produktion mit U. maydis und U. cynodontis deutlich gesteigert werden konnte. Die in dieser Arbeit entwickelten Produktionsstämme ermöglichen aufgrund eines stabilen einzelligen Wachstums neue verfahrenstechnische Strategien. Die Umsetzung dieser trägt zur zukünftigen Erweiterung der Anwendungsgebiete von Itaconsäure als wichtigem biobasierten Baustein bei.

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