Investigation of the binding profile and specificity of monoclonal IgA to microbiota communities under steady state and inflammatory conditions

Kabbert, Johanna; Pabst, Oliver (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Immunoglobulin A (IgA) ist der vorherrschende Antikörper-Isotyp im Darmlumen und spielt eine entscheidende Rolle für die Darm-Homöostase. IgA bindet Pathogene, Toxine und die intestinale Mikrobiota und trägt als wichtiger Bestandteil der intestinalen Immunabwehr maßgeblich zu einer stabilen Zusammensetzung der Mikrobiota bei. Zusätzlich zu IgA sind im menschlichen Darm auch geringe Mengen an IgG-Antikörpern vorhanden, die sich im Zuge von Entzündungen stark erhöhen. Eine Vielzahl von Faktoren nehmen Einfluss auf die Zusammensetzung der Darm-Mikrobiota. Wie im Gegenzug Antikörper-Antworten generiert und reguliert werden, um ein stabiles Gleichgewicht der Darm-Mikrobiota zu erhalten, ist noch immer weitestgehend unverstanden. Des Weiteren sind die Antigene der Darm-Mikrobiota, die von humanem IgA und IgG spezifisch erkannt werden, sowie die zugrunde liegenden Mechanismen solcher Antikörper-Mikrobiota-Interaktionen noch größtenteils unbekannt. In dieser Arbeit haben wir die Bindungskapazitäten und Spezifitäten von humanen monoklonalen Antikörpern (mAbs) für intestinale Mikrobiota mittels Durchflusszytometrie von Darmbakterien untersucht. Die humanen mAbs wurden von intestinalen IgA+ und IgG+ Plasmazellen (PCs) aus an Morbus Crohn (Crohn’s Disease, CD) erkrankten Patienten und gesunden Menschen (HD) generiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Vielzahl humaner IgA-Antikörper aus dem entzündeten und dem gesunden Darm gleichermaßen die Fähigkeit haben, einen großen Anteil der Mikrobiota zu binden. Wir konnten ebenfalls zeigen, dass auch humane IgG-Antikörper Bakterien der Darm-Mikrobiota binden. Um die Bindungsprofile von intestinalen Mikrobiota-reaktiven IgA-mAbs genauer zu bestimmen, wurden von IgA-gebundene und nicht gebundene fäkale Bakterien durchflusszytometrisch sortiert und die Zusammensetzung beider Fraktionen mittels 16SrRNA-Sequenzierung charakterisiert. Es zeigte sich, dass einige Bakterien-Taxa gleichermaßen von einem Großteil der mAbs gebunden wurden, während andere Taxa lediglich von einzelnen mAbs gebunden wurden. Außerdem zeigten alle hoch Mikrobiota-reaktiven HD und CD IgA mAbs, zusätzlich zu ihrer Bindungskapazität für phylogenetisch diverse Bakterien, individuelle Bindungsprofile. Dieses Phänomen bezeichnen wir als „cross-species“ Reaktivität. Von entscheidender Bedeutung ist, dass „cross-species“ Reaktivität nicht per se auf Polyreaktivität beruht (d.h. Bindungen zu strukturell-unterschiedlichen Antigenen), sondern wesentlich von der Akkumulierung somatischer Mutationen abhängt. Entsprechend ist eine hohe Anzahl an somatischen Mutationen kennzeichnend für „cross-species“-reaktive IgA-Antikörper. Dahingegen war die Fähigkeit Mikrobiota zu binden, bei einem Großteil aller mutierten mAbs in deren Keimbahnkonfiguration deutlich reduziert. Zusätzlich führte die Reversion dieser mAbs in die Keimbahnkonfiguration nicht zu deren Polyreaktivtät. Dies legt nahe, dass Mikrobiota-reaktive IgA mAbs nicht von ursprünglich-polyreaktivien Antikörpern abstammen. Wir vermuten daher, dass polyreaktive Antikörper, die früh während der Entwicklung entstehen, im Laufe des Lebens durch mutierte und affinitätsgereifte Antikörper ersetzt werden. Die hohe Anzahl akkumulierter, somatischer Mutationen lässt auf eine kontinuierliche Selektion dieser „cross-species“-reaktiven Antikörper während mehrerer Affinitäts-Reifungsschritte schließen und erfordert wahrscheinlich die Interaktion mit T-Zellen. Interessanterweise wurden nicht alle Bakterien einer Spezies einheitlich von „cross-species“-reaktiven Antikörpern gebunden. Dies könnte auf eine gezielte Bindung „cross-species“-reaktiver IgA-Antikörper an genetische Untergruppen innerhalb einer Bakterienspezies, oder aber an Bakterien in bestimmten Wachstumszuständen hindeuten. Zusammenfassend veranschaulichen unsere Daten, dass affinitätsgereifte, „cross-species“-reaktive Antikörper einen dominanten Mechanismus für die Interaktion zwischen IgA und der Mikrobiota im humanen Darm darstellen. Wir vermuten, dass „cross-species“ Reaktivität eine breite, aber dennoch spezifische Bindung von phylogenetisch diversen Darmbakterien ermöglicht, was sowohl im gesunden als auch im entzündeten Darm eine effiziente IgA-Mikrobiota Interaktion erlaubt. Vermutlich gewährleistet der kontinuierliche Kontakt mit vielfältigen, aber strukturell-ähnlichen Antigenen die Selektion von „cross-species“-reaktiven IgA-Antikörpern. Eine weitergehende Identifizierung der Darmbakterien, die von IgA unter homöostatischen oder entzündlichen Bedingungen gebunden werden, könnte perspektivisch die Entwicklung von Mikrobiota-spezifischen mAbs als diagnostisches oder therapeutisches Mittel ermöglichen. Ein weiterer Aspekt der intestinalen Immunität bezieht sich auf die Generierung von IgA-produzierenden PCs. Bisher ist nicht vollständig geklärt, welche induktiven Kompartimente des darmassoziierten-lymphatischen Gewebes maßgeblich an der Generierung von intestinalen IgA-Antworten unter homöostatischen Bedingungen beteiligt sind. Darüber hinaus ist noch ungewiss, inwiefern unter homöostatischen Bedingungen neu generierte IgA+ PCs einen Anteil zu bereits vorhandenen intestinalen PCs leisten. Um diese Fragen zu untersuchen, haben wir ein Mausmodell etabliert, das es erlaubt, die Differenzierung und Migrationskinetik aktivierter B-Zellen in vivo zu erfassen. In diesem Modell wird 4-Hydroxy-Tamoxifen lokal in einzelne Peyersche Platten (PPs) des Dünndarms injiziert. In der Folge erhalten B-Zellen, die in einer solchen PP aktiviert werden, eine irreversible Fluoreszenzmarkierung (eYFP), die es ermöglicht, aktivierte B-Zellen und ihre Nachkommen zu verfolgen. Wir konnten zeigen, dass im homöostatischen Zustand und in Abwesenheit von neo-Antigenen ein überraschend hoher Anteil aktivierter B-Zellen in PPs zu finden ist. Unsere Daten zeigen ferner, dass B-Zellen, die in einer bestimmten PP aktiviert wurden, durch verschiedene PPs re-zirkulieren und sich lediglich transient in den mesenterischen Lymphknoten aufhalten. Dies lässt vermuten, dass aktivierte B-Zellen Affinitätsreifungen in unterschiedlichen PPs durchlaufen, was zur Generierung von spezifischen IgA+ PCs führt. Zudem konnten wir zeigen, dass B-Zellen, die aus einem einzelnen PP stammen, zu IgA+ PCs differenzieren können und bis zu 90 Tage nach ihrer Induktion in der Lamina propria des Dünndarms nachweisbar sind. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierte Methode, könnte in Zukunft dazu genutzt werden, klonale Überlappungen des PC-Repertoires in verschiedenen Darmkompartimenten zu untersuchen. Des Weiteren wäre es möglich, funktionelle Unterschiede von IgA+ PCs, die im gesunden oder im entzündeten Darm generiert wurden, zu untersuchen. Demzufolge ermöglicht die lokale B-Zell Markierung in einzelnen PPs auch, die zugrundeliegenden Mechanismen der „cross-species“ Reaktiviät von IgA-Antworten gegen die intestinale Mikrobiota in weitergehenden Experimenten gezielt zu untersuchen.

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