Characterization of the molecular function of a novel effector of Sporisorium reilianum that impacts plant development

Agrawal, Nisha; Schirawski, Jan (Thesis advisor); van Dongen, Joost Thomas (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Sporisorium reilianum ist ein biotropher Brandpilz und verursacht Maiskopfbrand. Erkrankte Pflanzen zeigen eine geringere Größe, die Bildung von Sporen in den männlichen und weiblichen Blütenständen, die Bildung von Blättern anstelle von Blütenorganen, sowie die Ausbildung weiterer subapikaler Kolben durch die Unterdrückung der apikalen Dominanz. Für die Unterdrückung der apikalen Dominanz ist das Effektor Protein SAD1 verantwortlich, ohne dabei die Expression Auxin-abhängig regulierter Gene zu beeinflussen. SAD1 interagiert mit ZmRGLG1 und führt in Mais zu einer erhöhten Genexpression der abiotischen Stressantwort. Um besser verstehen zu können, wie genau SAD1 die Pflanzenentwicklung beeinflusst, sollte in dieser Arbeit die molekulare Interaktion zwischen SAD1 und den beiden E3 Ubiquitinligasen RGLG1 und RGLG2 näher untersucht werden. Hierfür wurde ein „yeast secretion trap assay“ durchgeführt mit dem ich zeigen konnte, dass SAD1 ein funktionierendes Signalpeptid besitzt, mit dessen Hilfe der Effektor während der Pflanzeninfektion von S. reilianum sekretiert werden kann. Ich erstellte erfolgreich markierte Versionen von SAD1, die eine interne HA- oder hexa-Histidin-Markierung tragen. Die markierten Versionen konnten die Funktion von SAD1 während der Infektion von S. reilianum vollständig ersetzen. Die markierten funktionsfähigen Versionen können nun zur Untersuchung der Lokalisation von SAD1 in Mais genutzt werden. Weitere gezielte Hefe zwei-Hybrid-Versuche zeigten, dass SAD1 mit ZmRGLG1 und ZmRGLG2 interagiert, sowie mit deren Homologen aus A. thaliana, AtRGLG1 und AtRGLG2. Zudem konnte ich durch Bimolekulare fluoreszenzkomplementation zeigen, dass SAD1 auch mit allen vier E3 Ubiquitinligasen im Zellkern und im Zytoplasma von N. benthamiana-Zellen interagiert. AtRGLG1 und AtRGLG2 sind wichtig für die Reaktion der Pflanze auf abiotischen Stress: rglg1rglg2 Doppelmutanten von A. thaliana zeigen einen Verlust der apikalen Dominanz. Um die Interaktion zwischen SAD1 und AtRGLG1/2 zu untersuchen, wurde das Fusionsprotein mCHERRY-SAD1 ohne Sekretionssignal peptid unter der Kontrolle des konstitutiven P35S:mcherry-SAD1ΔSP in rglg1, rglg2, und Col-0 Linien von A. thaliana exprimiert. Die resultierenden transgenen Pflanzenlinien zeigten mehr sekundäre Verzweigungen an stängelständigen Blättern sowie mehr primäre und sekundäre Verzweigungen an Rosetten-Blättern. Im Gegensatz dazu war das Wurzelwachstum von auf Platte ausgekeimten transgenen Jungpflanzen nicht beeinflusst. Durch in-vitro Ubiquitinierungs-Versuche konnte ich zeigen, dass SAD1 durch RGLG1 und RGLG2 sowohl aus A. thaliana als auch aus Zea mays in Anwesenheit der E2 Ubiquitin-konjugierenden Enzyme UbcH5b und UbcH13 ubiquitiniert werden kann. Ich vermute, dass SAD1 die Interaktion von RGLG1 und RGLG2 mit den natürlichen Interaktionspartnern stört. Ein bekannter Interaktionspartner von RGLG1 und RGLG2 ist ERF53. Dieses Protein wird in A. thaliana bei anhaltendem abiotischem Stress zur Degradation mit Ubiquitin markiert, um die Stressantwort abzuschwächen. Durch eine Störung dieser Interaktion würde der Transkriptions-faktor ERF53 länger aktiv bleiben, und dies würde zu einer verlängerten Genexpression der abiotischen Stressantwort führen und damit den Verlust der apikalen Dominanz auslösen. Zusätzlich zur weiteren Funktionsaufklärung des Pilzeffektors SAD1 liefern diese Ergebnisse neue Erkenntnisse zur apikalen Dominanz in Pflanzen. Meine Forschungsergebnisse deuten auf einen konservierten Signalweg zur Regulation der apikalen Dominanz hin, der gleichermaßen in Monokotylen und Dikotylen unabhängig von Auxin funktioniert und durch SAD1 beeinflusst werden kann. Ein besseres Verständnis, wie apikale Dominanz in Blütenständen funktioniert und wie diese beeinflusst werden kann, könnte auch die angewandte Pflanzenwissenschaft voranbringen, zum Beispiel durch die Entwicklung von Getreidesorten mit einer erhöhten Anzahl an Ähren, oder der Zucht von Zierpflanzen mit mehr Blüten.

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